AAT Bioquest11501 Amplite® Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Red Fluorescence* 500Tests 

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美國(guó)AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家為從事生命科學(xué)研究、診斷研發(fā)及藥物開發(fā)的科學(xué)家研發(fā)、生產(chǎn)和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，包括吸收（顏色），熒光和發(fā)光技術(shù)。AAT Bioquest的產(chǎn)品幫助quan世界的科學(xué)家和生物醫(yī)藥研究者更好的了解生物化學(xué)，免疫學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域。AAT Bioquest會(huì)不斷介紹新產(chǎn)品，快速的豐富各個(gè)領(lǐng)域的產(chǎn)品。

AAT Bioquest11501 Amplite® Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Red Fluorescence* 500Tests，產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

產(chǎn)品品牌：AAT Bioquest

產(chǎn)品貨號(hào)：11501

產(chǎn)品名稱：Amplite®熒光過(guò)氧化氫測(cè)定試劑盒*紅色熒光*

英文名稱：Amplite® Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Red Fluorescence*

產(chǎn)品規(guī)格：500 Tests

AATBioquestAmplite熒光過(guò)氧化氫測(cè)定試劑盒 

產(chǎn)品說(shuō)明：

過(guò)氧化*（H2O2）是一種活性氧代謝副產(chǎn)物，可作為許多氧化應(yīng)激相關(guān)狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。它涉及許多與哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、骨質(zhì)疏松癥、許多神經(jīng)退行性疾病和唐氏綜合癥有關(guān)的生物事件。也許H2O2生物學(xué)最有趣的方面是最近的報(bào)道，即抗體具有將分子氧轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化*的能力，有助于免疫系統(tǒng)的正常識(shí)別和破壞過(guò)程。測(cè)量這種反應(yīng)性物質(zhì)將有助于確定氧化應(yīng)激如何調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞內(nèi)途徑。Amplite 過(guò)氧化*檢測(cè)試劑盒使用我們的 Amplite®® Red 過(guò)氧化物酶底物來(lái)定量溶液和細(xì)胞提取物中的過(guò)氧化*。它還可用于通過(guò)酶偶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)各種氧化酶活性。該試劑盒是一種優(yōu)化的“混合和讀取"檢測(cè)，與 HTS 液體處理儀器兼容。

組件

組分A：安培™紅過(guò)氧化物酶底物 1瓶

組分B：H2O2 1 瓶（3% 穩(wěn)定溶液，200 μL）

組分C：檢測(cè)緩沖液 1 瓶 （100 mL）

組分D：辣根過(guò)氧化物酶 1瓶（20單位）

構(gòu)成部分E：DMSO 1 瓶 （1 mL）

示例協(xié)議

一目了然

協(xié)議摘要

1. 準(zhǔn)備 H₂O₂工作溶液 （50 μL）

2. 添加 H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品 （50 μL）

3. 在室溫下孵育 10 - 30 分鐘

4. 監(jiān)測(cè)Ex/Em = 540/590 nm處的熒光強(qiáng)度

重要說(shuō)明

在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍所有試劑盒成分。

重要說(shuō)明

組分A在DTT和β-巰基乙*等硫醇存在下不穩(wěn)定。硫醇高于10 uM（終濃度）會(huì)顯著降低測(cè)定動(dòng)態(tài)范圍。

重要說(shuō)明

NADH和谷胱gan肽（還原形式：GSH）可能會(huì)干擾測(cè)定。

儲(chǔ)備液的制備

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1. Amplite Red 過(guò)氧化物酶底物儲(chǔ)備溶液 （100X）：

將 250 μL DMSO（組分 E）加入到小瓶的 Amplite™™ Red 底物（組分 A）中。應(yīng)及時(shí)使用此儲(chǔ)備溶液。

2.過(guò)氧化物酶儲(chǔ)備溶液（20 U / mL）：

將1 mL測(cè)定緩沖液（組分C）加入辣根過(guò)氧化物酶（組分D）小瓶中。

3. H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液 （20 mM）：

加入22.7 μL 的3% H2O2（0.88 M，組分B）放入977μL檢測(cè)緩沖液（組分 C）中。注意：稀釋的H2O2溶液不穩(wěn)定。任何未使用的部分都應(yīng)丟棄。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

H2O2 標(biāo)準(zhǔn)

加入 1μL20 mM H2O2將溶液儲(chǔ)備到1999μL測(cè)定緩沖液（組分C）中，以獲得 10μM H2O2標(biāo)準(zhǔn) （HS7）。取10μM H2O2標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行 1：3 系列稀釋以獲得 H 的連續(xù)稀釋液2O2標(biāo)準(zhǔn)（HS6 - HS1）。

工作溶液的制備

將50μL Amplite™ 紅色過(guò)氧化物酶底物儲(chǔ)備溶液（100X）和200μL 過(guò)氧化物酶儲(chǔ)備溶液（20 U/mL）加入4.75 mL檢測(cè)緩沖液（組分 C）中，使總體積為 5mL。注意：避光保存。

實(shí)驗(yàn)方案樣本

H₂O₂上清液測(cè)定

1. 準(zhǔn)備 H₂O₂根據(jù)表96和表1中提供的布局，將標(biāo)準(zhǔn)品（HS）、空白對(duì)照（BL）和測(cè)試樣品（TS）放入純黑色2孔微孔板中。對(duì)于384孔板，每孔使用25μL 試劑而不是50μL。

2. 加入 50 μL H₂O₂工作溶液進(jìn)入H的每個(gè)孔中₂O₂標(biāo)準(zhǔn)、空白對(duì)照和測(cè)試樣品，使總H₂O₂測(cè)定體積為100μL/孔。對(duì)于384孔板，加入25μL H₂O₂相反，工作溶液的總體積為50μL/孔。

3. 將反應(yīng)在室溫下孵育15至30分鐘，避光。

4. 使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)= 540±10 nm，發(fā)射= 590±10 nm（最佳Ex / Em = 540/590 nm）監(jiān)測(cè)熒光增加。注意：板的內(nèi)容物也可以轉(zhuǎn)移到白色透明底部微孔板中，并由吸光度酶標(biāo)儀在576±5nm的波長(zhǎng)下讀取。然而，與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測(cè)的靈敏度較低。

H₂O₂細(xì)胞檢測(cè)

Amplite™熒光過(guò)氧化*檢測(cè)試劑盒可用于測(cè)量H的釋放₂O₂從細(xì)胞。以下是建議的方案，可以修改以滿足特定的研究需求。

1. The H₂O₂細(xì)胞工作溶液應(yīng)按上述方式制備，但應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中使用的培養(yǎng)基替換檢測(cè)緩沖液（組分C）。建議的培養(yǎng)基包括（a）克雷布斯林格斯磷酸鹽緩沖液（KRPB）;（b） 漢克斯平衡yan溶液;或 （c） 無(wú)血清培養(yǎng)基。

2. 在96孔板（50 - 100μL/孔）中制備細(xì)胞，并根據(jù)需要激活細(xì)胞。注意：包括陰性對(duì)照（單獨(dú)培養(yǎng)基和非活化細(xì)胞）用于測(cè)量背景熒光。對(duì)于384孔板，改用25μL/孔的細(xì)胞培養(yǎng)基。

3. 加入50μL H₂O₂細(xì)胞工作溶液進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞孔和H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于384孔板，加入25μL H₂O₂將細(xì)胞工作溶液改為放入每個(gè)孔中。

4. 將反應(yīng)在室溫下孵育15至30分鐘，避光。

5. 使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)= 540±10 nm，發(fā)射= 590±10 nm（最佳Ex /Em = 540/590 nm）監(jiān)測(cè)熒光增加。

 AATBioquestAmplite熒光過(guò)氧化氫測(cè)定試劑盒 

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